良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。由于免疫組化染色過(guò)程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個(gè)步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的zui終結(jié)果，因此，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技術(shù)員和病理醫(yī)生密切配合、相互協(xié)調(diào)、共同努力才能保證做出合格的免疫組化切片。雖然免疫組化染色可以存在各種各樣的問(wèn)題，但從染色的結(jié)果看，一般可分為兩類：無(wú)色片（即無(wú)陽(yáng)性信號(hào)）和“雜音”染色片（有陽(yáng)性信號(hào)）。

一、 無(wú)色片
染色結(jié)束后，切片中見(jiàn)不到任何陽(yáng)性信號(hào)。這是常規(guī)工作中比較常見(jiàn)的現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，有兩種可能：1、真陰性結(jié)果：整個(gè)染色過(guò)程沒(méi)有出現(xiàn)問(wèn)題，組織或細(xì)胞確實(shí)不表達(dá)與抗體相關(guān)的抗原。2、假陰性結(jié)果：即此陰性結(jié)果不是真實(shí)的反映。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：（1）、切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況，要麼是病理醫(yī)生選擇錯(cuò)了切片或抗體選錯(cuò)了，要麼是技術(shù)員選錯(cuò)了蠟塊。獲得正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結(jié)果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術(shù)員的事，病理醫(yī)生也起著*的作用。（2）、染色過(guò)程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問(wèn)題。比如，組織未進(jìn)行抗原修復(fù)，有的組織必須經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)才能檢測(cè)抗原表達(dá)；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個(gè)逐漸的過(guò)程，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長(zhǎng)期不用和/或已超過(guò)有效期是主要的原因。也可見(jiàn)于染色過(guò)程中漏掉了某一環(huán)節(jié)，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時(shí)少了過(guò)氧化氫。為了避免這種簡(jiǎn)單的錯(cuò)誤，有一種簡(jiǎn)單的方法：在三抗孵育結(jié)束時(shí)，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現(xiàn)棕色。如果出現(xiàn)了，證明三抗和DAB的配制過(guò)程沒(méi)有錯(cuò)誤。如果這種DAB再滴到切片上沒(méi)有出現(xiàn)任何陽(yáng)性信號(hào)，問(wèn)題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問(wèn)題肯定在三抗DAB或DAB的配制過(guò)程。這種簡(jiǎn)單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問(wèn)題可能的原因。
    解決陰性染色的問(wèn)題非常簡(jiǎn)單，就是設(shè)立“陽(yáng)性對(duì)照”。如果陽(yáng)性對(duì)照有了表達(dá)，說(shuō)明染色的全過(guò)程和所有試劑都沒(méi)有問(wèn)題。如果此時(shí)測(cè)試片仍為陰性，便是真實(shí)的陰性，說(shuō)明組織或細(xì)胞沒(méi)有相應(yīng)的抗原表達(dá)。反之，如果陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有著色，表明染色過(guò)程中某個(gè)或某些步驟出了問(wèn)題或試劑出了問(wèn)題。應(yīng)一一尋找原因。陽(yáng)性對(duì)照包括兩種，一種稱為“自身對(duì)照”或“內(nèi)部對(duì)照”，這是指在測(cè)試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結(jié)中存在T和B細(xì)胞抗原，CD20或CD3都應(yīng)該有表達(dá)。自身對(duì)照是一種比較理想的對(duì)照，對(duì)照和測(cè)試組織或細(xì)胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗(yàn)條件下，結(jié)果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對(duì)照片時(shí)選擇既有病變組織同時(shí)又有正常組織的部分，這樣有利于對(duì)比。另一種稱為“外部對(duì)照”，有時(shí)在測(cè)試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標(biāo)本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來(lái)檢測(cè)，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原，如果病變出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果，尚能提示是惡黑，但是如果出現(xiàn)陰性結(jié)果，就無(wú)法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問(wèn)題。因此，應(yīng)另外設(shè)立一個(gè)已知的陽(yáng)性對(duì)照。這種在測(cè)試組織之外的陽(yáng)性對(duì)照稱為“外部對(duì)照”。在實(shí)際工作中需要設(shè)立外部對(duì)照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽(yáng)性對(duì)照，工作量會(huì)很大。為了解決這個(gè)問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等，其連續(xù)切片儲(chǔ)備待用，需要時(shí)取出一張便可作為陽(yáng)性對(duì)照。另外，比較簡(jiǎn)單的方法，是采用闌尾作為陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)榕c人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、血管、神經(jīng)、間皮等。一張闌尾切片可以檢測(cè)大多數(shù)常用的抗體。
    設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照是病理醫(yī)生的任務(wù)或責(zé)任，而不是技術(shù)員的責(zé)任。病理醫(yī)生觀察了HE切片，了解切片中是否有自身對(duì)照，如果沒(méi)有，就應(yīng)告訴技術(shù)員采用陽(yáng)性對(duì)照。因此，病理醫(yī)生在免疫組化中的作用是不可忽視的。
抗體未覆蓋上測(cè)試組織：當(dāng)多塊散開(kāi)的小組織染色時(shí)，可能漏掉某塊組織染色。
二、“雜音”染色片
免疫組化除正常的真實(shí)的陽(yáng)性信號(hào)外常常會(huì)遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音”染色。“雜音”染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說(shuō)明，筆者將其歸納為下面幾種。
1、 全片著色
全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：
（1）、抗體濃度過(guò)高：一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書進(jìn)行染色。
（2）、抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
（3）、DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
（4）、組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

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